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肝微粒体试验中的问题

时间: 2012-04-26 11:51:01 作者: 来源: 字号:
最近做肝微粒体试验,觉得试验中很多细节论坛中没有大家有什么经验可否交流一下,我先谈谈在论坛中的收获,和自己的一些想法。




首先声明,我是新手(俗称菜鸟),知识水平低,所以,有些地方说的不对,请大家指出。我前面是做大鼠体内药动的,一种新药A和已知药B,由于A为多糖类不易检测,所以通过做B的代谢来研究A的代谢(A、B药效相同,A上市后很可能与B合用)。试验结果表明联合用药后大鼠药物B的AUC显着增加了,而半衰期显着减少了,雄性大鼠比雌性大鼠差异要大些。结果出来后我就郁闷了,AUC显着增加说明A对B的代谢酶有抑制作用或对促进B的吸收;但半衰期显着减少应是A对B的代谢酶有诱导作用。结论相反阿?如果,A促进B的吸收,在吸收方面,性别差异应不大,为何雌雄差异很大呢?
请教了论坛上的前辈,我觉得下一步应该做体外肝微粒体酶试验,我做的药的代谢酶是P450系列。通过查看文献,我发现:
诱导……可测P450总量,其结果应为增加趋势,这需要连续灌胃,对其进行诱导。
抑制……可测酶的Vmax和Km.,需要通过体外孵育。
联合用药……还可测药在肝微粒中的代谢速度(即时间浓度曲线)




肝微粒体的制备
1.??处死动物,尽可能快的取出肝脏(看有的文献说用注射器吸预冷的生理盐水20-40ml从门静脉冲洗,有的是取出组织后放入冰蔗糖溶液冲洗,还有剪碎后放到PBS里冲洗的,不知有何区别?)
2.??吸干组织并称重
3.??匀浆(匀浆机是什么样的好像有内切式的和捣碎式的?匀浆多久?时间长了是否酶失活了?)匀浆液也有不同(1、0.25mol/L蔗糖溶液,2、PBS)
4.??制备线去粒体上清液:匀浆在9000g离心15min,保留上清液,再在匀浆在19000g离心20min,保留上清液.
5.??用超速离心法制备微粒体碎片:取去线粒体上清液在在19000g离心20min,弃去上清液,再用含30%甘油的0.1mol/L,pH7.4的Tris缓冲液or 0.1mol/L,pH7.4的PBS重新悬浮。(PBS是指0.1mol/L,pH7.4的磷酸缓冲液吧?我参考文献说0.15mol/L KCl的0.1mol/L,pH7.4的磷酸钾缓冲液PBS是怎么回事?)
6.??用氯化钙沉淀法制备微粒体碎片:取去线粒体上清液,加入氯化钙溶液,使氯化钙浓度为8mmol/L, 搅拌5min,并在27000g下离心15min,弃去上清液,再用含30%甘油的 0.1mol/L,pH7.4的Tris缓冲液重新悬浮.
7.??问题Tris和PBS缓冲液如何配制?




蛋白测定
为了消除个体差异通常将几只大鼠的肝混在一起测定蛋白吧?
P450的测定
问题:不是测定450nm,490nm吸收度差值为什么还要做400~500nm处基线扫描呢?CO是用甲酸和浓硫酸反应得到的,在什么装置中呢?如何让反应停止呢,还是大家在通风橱里做的,这个有危险性吧。




孵育条件
1.??Tris或PBS缓冲液,MgCl2, NADP, 6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶,烟酰胺溶液。
2.??Tris或PBS缓冲液,MgCl2, NADP, 枸橼酸三钠,枸橼酸脱氢酶,烟酰胺溶液。
3.??NADP/NADPH启动液(不是有NADPH了吗?有些文献为何还要加NADPH再生系统?不明白!!!!)
4.??首先要确定最佳孵育时间,即先固定一个酶蛋白浓度(低于0.5mg蛋白/ml以减少蛋白结合),底物浓度是测定的最低浓度,选择线性范围内的时间点。然后确定最佳酶浓度,即选择不同的酶浓度底物浓度同上,孵育上述最佳时间后,以酶浓度与代谢速度做非线性回归方程,择线性范围内的最佳酶浓度。
5.??37℃预孵育3~5min.加入启动液。
6.??孵育后的样品4℃,离心去蛋白,测定剩余样品。
7.??注意:对亲脂性药物,为保持酶活性,加入孵育体系的有机量要小于0.5%(v/v); 反应体系的浓度看看文献
8.??问题:启动液一般是用NADP吧?我的文献为什么是加入药后开始启动的呢?烟酰胺要不要加阿?MgCl2, 6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶可以配在一起吧?不知道NADP, 6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶大家都怎么配的?我看论坛上有人说配成1ml,20ul分装。(感觉不错,不知哪位大侠还有高招)
计算与结果
用Eadie-Hofstee方程计算最大反应速度Vmax和米氏常数Km
它是以底物减少的速度 v为纵坐标,以v/[s] (s为底物浓度)为横坐标。




希望能得到高手指导,更希望对将要做这方面的同志有帮助。写了这么多(虽然问的更多),版主能否给加分呀?(先汗一个!)




曾苏主编. 药物代谢学. 杭州:浙江大学出版社,2004
姚彤炜主编. 体内药物分析. 杭州:浙江大学出版,2001
可参考,前者有制备和实验方法,后者有很多应用的例子。




6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶或枸橼酸三钠,枸橼酸脱氢酶就是要把代谢生成的NADP+再转换成NADPH,这样就可以节约NADPH的用量。NADH和NADPH都属于辅酶,加什么要看你的酶促反应需要那种辅酶。配就是天平称量再溶解。这个溶液可以放在-20度冻着,用时候解冻就可以了。一次可多配点。




消除个体差异需要每只老鼠制备的微粒体都要单独测定,然后不同老鼠时候以加的蛋白总量为准。P450测定十分难做,呵呵所以有时候测不好就不要了。




门静脉打针是为了去除肝中的血,因为血蛋白对于酶蛋白测定有一定的影响。我们是先组织刀切碎,再用玻璃的那个来磨。注意要在冰上操作,否则酶容易失活。溶液怎么配请看我发的资料,那里有详细的说明。




做这个体外试验,最好先查明该药物的代谢途径,一相还是二相,再选择相应的反应体系。如果没有先做预试验看看。




明天就要放假了,可是窗外飘着鹅毛大雪,不知出行是否顺利!!!申请加分呵呵。




楼上的朋友,能不能把你的资料也发给我一份,多谢!邮箱:linly82@126.com




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